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microRNA芯片:

RNA干扰(RNA Interference, RNAi)现象是一种进化上保守的抵御或外来病毒qin犯的防御机制。将含有靶基因mRNA同源互补序列的RNA（Double strand RNA， dsRNA）导入细胞后，能够特异地识别该mRNA，引起mRNA的降解，从而导致相应的功能缺失。另一个加入Opti-MEM、lipo2000，然后将两管混匀。RNAi提供了一种经济、快捷、gao效的抑制特异基因表达的技术手段,该技术已被广泛用于研究基因功能和chuan染性疾病及恶xingzhong瘤基因zhi疗领域。目前常用的RNA干扰手段为miRNA、 shRNA和siRNA等。

MiRNA是一类可以通过RNAi机制调节基因表达的内源性小RNA，人工miRNA与shRNA的设计原理基本相同，由于miRNA具有内源性，因此其更易产生有效的基因沉默。

技术流程：

dsRNA或pre-miRNA被导入细胞后，能够被一种特异的核酸内切酶（Dicer）识别并切割成为小片段，这些片段在RNA解旋酶的作用下解链。继之反义链在与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-Induced Silencing Complex，RISC），RISC与mRNA同源区进行特异性结合，若miRNA与mRNA的结合位点配对，则切割mRNA；若miRNA与mRNA的结合位点不配对，则抑制mRNA的翻译。98C变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96C10s，50C5s，60°C4min，25个循环，扩增结束后设置4C保温。

逆转录病毒构建及包装

逆转录病毒（Retrovirus）是一类RNA病毒。在逆转录酶的作用下，以病毒RNA为模板合成cDNA再通过DNA、转录、翻译等过程形成病毒颗粒。逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白表达系统，由逆转录病毒载体、辅助载体（表达病毒包装需要的蛋白质）和包装细胞系组成。固定的蛋白质DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNAl片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。逆转录病毒载体在外源基因表达、基因沉默、、生物制药等得到广泛的应用。逆转录病毒载体主要优点：转染范围广，可以各种细胞类型，转入的外源基因可完全融合，对细胞率高，细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。

逆转录病毒载体系统共有两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了和包装信号，通过分子技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36士1°C培养18-24h，观察菌落形态。当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配，该病毒颗粒可其它宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的毒颗粒，保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。

◆　HPLC

如果合成的寡核苷酸应用于，定向诱变或定量的基因探测，那么对其纯度要求较高。脱盐或OPC纯化的寡核苷酸可能达不到要求，则HPLC纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂，阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。阴离子交换树脂的HPLC通常显示95-98%纯化效率，对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的HPLC与阴离子交换树脂的HPLC呈现相似的纯化效率。因为HPLC的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度，用HPLC法不能有效纯化长的寡核苷酸（大于35-mer)。

◆　PAGE

对于长的寡核苷酸的纯化（50-100mer），我们推荐PAGE纯化法，它使用交连的聚酰胺凝胶(电泳)作为纯化基质。LncRNA芯片Longnon-codingRNAs（lncRNAs）是一类转录本长度超过200nt的功能性非编码RNA分子。尽管PAGE显示出高的纯化效率（＞98%），但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。